基因表达载体的构建步骤(基因表达载体包括哪几部分)

基因表达载体构建的步骤如下：

1. 目的基因获取：在进行PCR之前，需要先针对自己的基因设计对应的引物；提取与所需表达的基因同源的细胞或组织中的RNA，并经过RT程序将其转化为cDNA；PCR扩增出所需要的基因片段。

2. 载体构建：载体构建（vector construction）是分子生物学研究常用的手段之一。依赖于限制性核酸内切酶、DNA连接酶和其它修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。

3. 挑取克隆提质粒验证：挑取单菌落接种于含载体对应抗性的LB培养液中，200rpm，37℃恒温摇床培养过夜，用质粒小量提取试剂盒提取质粒，再进行双酶切验证、测序验证。

1.启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首段，是RNA聚合酶识别和结合的部分，能驱动基因转录出 mRNA，最终获得所需蛋白质

2.终止子：一段有特殊结构的DNA短片段,转录结束的标志

3.标记基因：共重组DNA的鉴定和选择

4.复制原点：DNA复制起点,即DNA聚合酶结合位点

5.目的基因：这个一定得有

基因工程（genetic engineering）

构成：启动子、终止子、标记基因、目的基因

又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。

操作步骤如下：

1、用一定的限制酶切割质粒，使质粒出现缺口，露出黏性末端；

2、再用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端；

3、将切下的目的基因的片段插入质粒的切口处；

4、再使碱基互补配对结合，两个黏性末端吻合在一起，碱基之间形成氢键；

5、再加入适量的DNA连接酶，催化两条DNA链之间形成磷酸二酯键，从而将相邻的脱氧核糖核酸连接起来，形成一个重组DNA分子。

1、首先要用一定的限制酶切割质粒，使质粒出现一个缺口，露出黏性末端。

2、用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端。

3、将切下的目的基因的片段插入质粒的切口处，首先碱基互补配对结合，两个黏性末端吻合在一起，碱基之间形成氢键。

4、再加入适量DNA连接酶，催化两条DNA链之间形成磷酸二酯键，从而将相邻的脱氧核糖核酸连接起来，形成一个重组DNA分子。如人的胰岛素基因就是通过这种方法与大肠杆菌中的质粒DNA分子结合，形成重组DNA分子。

基因表达载体的构建，即目的基因与运载体结合，是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心，其构建目的是使目的基因能在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。

构建条件：

1、必须能够在宿主细胞中复制，使重组基因能够在宿主基因中复制，从而稳定保存下来，这是作为运载体的必须条件。

2、具有多个限制酶切点，从而可以使不同的粘性末端与之相连，增强实用性。

3、拥有标记基因，方便质粒进入宿主细胞后容易被检测出来，以便检测目的基因是否导入受体。

基因表达载体的构建，即目的基因与运载体结合，是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心；

其构建目的是使目的基因能在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。